低溫電鏡解析蛋白結構進展

　　結構生物學領域有一條不成文的觀點：結構決(jue) 定功能。隻有知道生物分子的原子排布，科學家們(men) 才能了解這個(ge) 蛋白的功能。幾十年來，分析蛋白結構有一個(ge) 無冕*——X射線晶體(ti) 衍射。在X射線晶體(ti) 衍射中，科學家們(men) 讓蛋白結晶，然後利用X射線照射，隨後根據X射線的衍射來重建蛋白的結構。在蛋白質數據銀行(Protein Data Bank)的100000多條蛋白詞目裏，超過90%的蛋白結構是利用X射線晶體(ti) 衍射技術解析得到的。

　　盡管X射線晶體(ti) 衍射一直是結構生物學家的*工具，但是它存在較大的限製。科學家們(men) 將蛋白進行大塊結晶通常需要多年的時間。而很多基礎蛋白分子，例如嵌在細胞膜上的蛋白，或是形成複合體(ti) 的蛋白卻無法被結晶。

　　X射線晶體(ti) 衍射技術(X-ray crystallography)即將成為(wei) 曆史，低溫電子顯微技術(cryo-electron microscopy, 也稱作electron cryomicroscopy, cryo-EM)引發結構生物學變革。

　　低溫電子顯微鏡適用於(yu) 研究大的、穩定的分子，這些分子能夠承受電子的轟擊，而不發生變形——由多個(ge) 蛋白組成的分子機器是的樣本。因此由RNA緊緊圍繞的核糖體(ti) 是*的樣本。三位化學家用X射線晶體(ti) 衍射研究核糖體(ti) 溶液的工作在2009年獲得了諾貝爾化學獎，但這些工作花了幾十年。近幾年，低溫電鏡研究者們(men) 也陷入了“核糖體(ti) 熱”。多個(ge) 團隊研究了多種生物的核糖體(ti) ，包括人類核糖體(ti) 的*高清模型。X射線晶體(ti) 衍射的研究成果遠遠落後於(yu) LMB的Venki Ramakrishnan實驗室，Venki獲得了2009年的諾獎。Venki表示，對於(yu) 大分子來說，低溫電子顯微鏡遠比X射線晶體(ti) 衍射要實用。

　　這幾年，低溫電子顯微鏡的相關(guan) 文章有很多：2015年一年，這個(ge) 技術就用於(yu) 100多個(ge) 分子的結構研究。X-射線晶體(ti) 衍射隻能對單個(ge) 、靜態的蛋白晶體(ti) 成像，但低溫電子顯微鏡能夠對蛋白的多種構象進行成像，幫助科學家們(men) 推斷蛋白的功能。

　　現在低溫電鏡迅猛發展，專(zhuan) 家們(men) 正在尋找更大的挑戰作為(wei) 下一個(ge) 解析目標。對很多人來說，zui想解析的是夾在細胞膜內(nei) 的蛋白。這些蛋白是細胞信號通路中的關(guan) 鍵分子，也是比較熱門的藥物靶標。這些蛋白很難結晶，而低溫電子顯微鏡不大可能對單個(ge) 蛋白進行成像，這是因為(wei) 很難從(cong) 背景噪音中提取這些信號。

　　這些困難都無法阻擋加利福利亞(ya) 大學(University of California)的生物物理學家程亦凡。他計劃解析一種細小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是檢測辣椒中引起灼燒感的物質的受體(ti) ，並與(yu) 其它痛感蛋白緊密相關(guan) 。加利福利亞(ya) 大學病理學家David Julius等人之前嚐試結晶TRPV1，結果失敗。用低溫電子顯微鏡解析TRPV1項目，一開始進展緩慢。但2013年底，技術進步使得這一項目有了重大突破，他們(men) 獲得了分辨率為(wei) 0.34納米的TRPV1蛋白的結構。該成果的發表對於(yu) 領域來說，無異於(yu) 驚雷。因為(wei) 這證實了低溫電子顯微鏡能夠解析小的、重要的分子。

　　盡管低溫電子顯微鏡發展迅速，很多研究者認為(wei) ，它仍有巨大提升空間。他們(men) 希望能製造出更靈敏的電子探測器，以及更好地製備蛋白樣本的方法。這樣的話，就能夠對更小的、更動態的分子進行成像，並且分辨率更高。5月，有研究者發表了一篇細菌蛋白的結構，分辨率達到了0.22納米。這也顯示了低溫顯微鏡的潛力。

　　1997年時，英國醫學研究委員會(hui) 分子生物學實驗室結構生物學家Richard Henderson非常堅定地宣稱，低溫電鏡會(hui) 成為(wei) 解析蛋白結構的主流工具。在將近20年後的今天，他的預測比當年有了更多底氣。Henderson表示，如果低溫電鏡保持這樣的勢頭繼續發展，技術問題也得以解決(jue) ，那麽(me) 低溫電鏡不僅(jin) 會(hui) 成為(wei) 解析蛋白結構的*選擇，而是主流選擇。這個(ge) 目標已經離我們(men) 不遠了。

　　1. 施一公小組在《Science》發兩(liang) 篇論文報道剪接體(ti) 三維結構

　　U4/U6.U5 tri-snRNP電鏡密度及三維結構示意圖。

　　2015年8月21日，清華大學生命科學學院施一公教授研究組在*期刊《科學》(Science)同時在線發表了兩(liang) 篇背靠背研究長文，題目分別為(wei) “3.6埃的酵母剪接體(ti) 結構”(Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 Angstrom Resolution)和“前體(ti) 信使RNA剪接的結構基礎”(Structural Basis of Pre-mRNA Splicing)。*篇文章報道了通過單顆粒冷凍電子顯微技術(冷凍電鏡)解析的酵母剪接體(ti) 近原子分辨率的三維結構，第二篇文章在此結構的基礎上進行了詳細分析，闡述了剪接體(ti) 對前體(ti) 信使RNA執行剪接的基本工作機理。清華大學生命學院博士後閆創業(ye) 、醫學院博士研究生杭婧和萬(wan) 蕊雪為(wei) 兩(liang) 篇文章的共同*作者。

　　這一研究成果具有極為(wei) 重大的意義(yi) 。自上世紀70年代後期RNA剪接的發現以來，科學家們(men) 一直在步履維艱地探索其中的分子奧秘，期待早日揭示這個(ge) 複雜過程的分子機理。施一公院士研究組對剪接體(ti) 近原子分辨率結構的解析，不僅(jin) 初步解答了這一基礎生命科學領域長期以來備受關(guan) 注的核心問題，又為(wei) 進一步揭示與(yu) 剪接體(ti) 相關(guan) 疾病的發病機理提供了結構基礎和理論指導。詳細新聞報道參見：施一公研究組在《科學》發表論文報道剪接體(ti) 組裝過程重要複合物U4/U6.U5 tri-snRNP的三維結構。(Science, 20 Aug 2015, doi: 10.1126/science.aac7629; doi: 10.1126/science.aac8159)

　　2. Science：HIV重大突破!*zui詳細HIV包膜三維結構出爐!

　　這項研究解析出HIV Env三聚體(ti) 處於(yu) 自然狀態下的高分辨率結構圖，其中HIV利用Env三聚體(ti) 侵入宿主細胞。圖片來自The Scripps Research Institute。

　　在一項新的研究中，TSRI的研究人員解析出負責識別和感染宿主細胞的HIV蛋白的高分辨率結構圖片。相關(guan) 研究結果發表在2016年3月4日那期Science期刊上，論文標題為(wei) “Cryo-EM structure of a native, fully glycosylated, cleaved HIV-1 envelope trimer”。

　　這項研究是解析出這種被稱作包膜糖蛋白三聚體(ti) (envelope glycoprotein trimer，以下稱Env三聚體(ti) )的HIV蛋白處於(yu) 自然狀態下的結構圖。這些也包括詳細地繪製這種蛋白底部的脆弱位點圖，以及能夠中和HIV的抗體(ti) 結合位點圖。(Science, 04 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2450)

　　3. Nature：*zui詳細轉錄因子TFIID三維結構出爐，力助揭示人類基因表達秘密

　　在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校、勞倫(lun) 斯伯克利國家實驗室和西班牙國家研究委員會(hui) (CSIC)羅卡索拉諾物理化學研究所的研究人員在理解我們(men) 體(ti) 內(nei) 被稱作轉錄起始前複合物(pre-initiation complex, PIC)的分子機構(molecular machinery)如何發現合適的DNA片段進行轉錄方麵取得重大進展。他們(men) *地詳細呈現一種被稱作TFIID的轉錄因子所發揮的作用。相關(guan) 研究結果於(yu) 2016年3月23日在線發表在Nature期刊上，論文標題為(wei) “Structure of promoter-bound TFIID and model of human pre-initiation complex assembly”。論文通信作者是勞倫(lun) 斯伯克利國家實驗室生物物理學家Eva Nogales，論文*作者是Nogales實驗室生物物理學研究生Robert Louder。其他作者是Yuan He、José Ramón López-Blanco、Jie Fang和Pablo Chacón。

　　這一發現是非常重要的，這是因為(wei) 它為(wei) 科學家們(men) 理解和治療一係列惡性腫瘤鋪平道路。Eva Nogales說，“理解細胞中的這種調節過程是操縱它或當它變壞時修複它的*方式。基因表達是包括從(cong) 胚胎發育到癌症在內(nei) 的很多重要生物學過程的關(guan) 鍵。一旦我們(men) 能夠操縱這些基本機製，那麽(me) 我們(men) 就能夠要麽(me) 校正應當或不應當存在的基因表達，要麽(me) 阻止這種過程[即基因表達]失去控製時的惡性狀態。”(Nature, 31 March 2016, doi:10.1038/nature17394)

　　4. Science：科學家成功解析人類剪接體(ti) 關(guan) 鍵結構

　　在zui近發表的一篇Science研究論文中，來自德國的科學家們(men) 利用冷凍電鏡技術在分子級分辨率水平上重現了人類剪接體(ti) 中一個(ge) 關(guan) 鍵複合體(ti) ——U4/U6.U5 tri-snRNP的結構。剪接體(ti) 是一種由RNA和蛋白質組成的用於(yu) 切掉mRNA前體(ti) 中內(nei) 含子的分子機器。該研究解析的U4/U6.U5 tri-snRNP是構成剪接體(ti) 的一個(ge) 重要組成部分，研究人員利用單顆粒冷凍電鏡獲得了人類U4/U6.U5 tri-snRNP的三維結構，該複合體(ti) 分子量達到180萬(wan) 道爾頓，解析分辨率達到7埃。該研究模型揭示了Brr2 RNA解螺旋酶如何在分離的人類tri-snRNP中通過空間結構阻止未成熟的U4/U6 RNA發生解鏈，還展現了泛素C端水解酶樣蛋白Sad1如何將Brr2固定在預激活位置。

　　研究人員將他們(men) 獲得的結構模型與(yu) 釀酒酵母tri-snRNP以及裂殖酵母剪接體(ti) 的結構進行了對比，結果表明Brr2在剪接體(ti) 激活過程中發生了顯著的構象變化，支架蛋白Prp8也發生了結構變化以容納剪接體(ti) 的催化RNA網絡。(Science, 25 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2085)

　　5. 北京大學毛有東(dong) 、歐陽頎課題組與(yu) 其合作者在Science發表炎症複合體(ti) 冷凍電鏡結構

　　炎症複合體(ti) 三維結構

　　北京大學物理學院毛有東(dong) 研究員、北京大學物理學院/定量生物學中心歐陽頎院士與(yu) 哈佛醫學院吳皓教授合作利用冷凍電子顯微鏡技術解析了近原子分辨率的炎症複合體(ti) 的三維結構，闡釋了其複合物在免疫信號轉導過程中的單向多聚活化的分子結構機理。該研究工作以“Cryo-EM Structure of the Activated NAIP2/NLRC4 Inflammasome Reveals Nucleated Polymerization”為(wei) 題於(yu) 2015年10月8日在線發表在期刊Science。

　　先天免疫是人類免疫係統的重要組成部分，炎症複合體(ti) 在觸發先天免疫響應的過程中起到了關(guan) 鍵信號轉導的效應器作用，從(cong) 而啟動細胞凋亡等免疫應答和炎症反應。炎症複合體(ti) 是胞漿內(nei) 一組複雜的多蛋白複合體(ti) ，是胱天蛋白酶活化所必需的反應平台，其複合物單體(ti) 由多個(ge) 結構域構成，並在上遊蛋白的激活下誘導組裝形成環狀複合物。炎症複合體(ti) 的結構對於(yu) 認識先天免疫的信號轉導過程、免疫調控和病原誘導活化等免疫響應機理具有關(guan) 鍵的核心價(jia) 值，因而成為(wei) 國內(nei) 外*結構生物學和免疫學實驗室追捧的研究對象。(Science, 23 Oct 2015, 10.1126/science.aac5789)

　　6. Nature：施一公團隊揭示γ-分泌酶原子分辨率結構

　　人體(ti) γ-分泌酶3.4埃三維結構

　　日前，清華大學教授施一公團隊與(yu) 國外學者合作，構建了分辨率高達3.4埃的人體(ti) γ-分泌酶的電鏡結構，並且基於(yu) 結構分析了γ-分泌酶致病突變體(ti) 的功能，為(wei) 理解γ-分泌酶的工作機製以及阿爾茨海默氏症的發病機理提供了重要基礎。相關(guan) 成果8月18日在《自然》發表。

　　阿爾茨海默氏症是zui為(wei) 嚴(yan) 峻的老年神經退行性疾病之一，但其發病機理尚待揭示。目前研究已知β-澱粉樣沉澱是該病的標誌性症狀之一。而β-澱粉樣沉澱的產(chan) 生是APP蛋白經過一係列蛋白酶切割產(chan) 生的短肽聚集而來。在此切割過程中，zui關(guan) 鍵的蛋白酶是γ-分泌酶。γ-分泌酶由四個(ge) 跨膜蛋白亞(ya) 基組成，其中，編碼Presenilin(PS1)蛋白的基因中有200多個(ge) 突變與(yu) 阿爾茨海默氏症病人相關(guan) 。γ-分泌酶在阿爾茨海默氏症的發病中扮演著重要角色。

　　研究人員通過收集更多的數據、大量的計算並升級分類方法，計算構建出3.4埃原子分辨率γ-分泌酶的三維結構，可以觀察到絕大部分氨基酸的側(ce) 鏈以及胞外區部分糖基化修飾和結合的脂類分子。在高分辨結構的基礎上，施一公研究組對PS1上的致病性突變體(ti) 進行了研究，發現這些突變主要集中在兩(liang) 個(ge) 較為(wei) 集中的區域內(nei) 。他們(men) 對於(yu) 其中一些突變體(ti) 進行了生化性質的研究，發現這些突變會(hui) 影響γ-分泌酶對於(yu) 底物APP的酶切活性，然而對切割活性的影響卻有所不同。(Nature, 10 September 2015, doi:10.1038/nature14892)

　　7. Nature：人類核糖體(ti) 結構終於(yu) 被解析!

　　核糖體(ti) 是進行蛋白質翻譯的機器，能夠催化蛋白質合成。目前，許多研究已經對多種生物的核糖體(ti) 結構進行了原子水平的結構解析，但獲得人核糖體(ti) 結構一直存在很大挑戰，這一問題的解決(jue) 對於(yu) 人類疾病的深入了解以及治療手段和策略的開發都有重要意義(yi) 。

　　近日，學術期刊nature在線發表了法國科學家關(guan) 於(yu) 人類核糖體(ti) 結構解析的研究進展。

　　在該項研究中，研究人員利用高分辨率單顆粒低溫電子顯微鏡以及原子模型構建的方法獲得了人類核糖體(ti) 接近原子水平的結構。該核糖體(ti) 結構的平均分辨率為(wei) 3.6A，接近zui穩定區域的2.9A分辨率水平。這一研究成果對人類核糖體(ti) RNA，氨基酸側(ce) 鏈的實體(ti) 結構，特別是轉運RNA結合位點以及tRNA脫離位點處的特定分子相互作用提供了深入見解，揭示了核糖體(ti) 大小亞(ya) 基接觸麵的原子細節，發現在核糖體(ti) 大小亞(ya) 基的旋轉運動過程中，其接觸麵發生了強烈的重構過程。(Nature, 30 April 2015, doi:10.1038/nature14427)

　　8. Nature：日本科學家成功解析代謝關(guan) 鍵因子受體(ti) 結構

　　近日，學術期刊nature在線發表了日本科學家的研究進展，他們(men) 利用結構生物學方法對脂聯素(adiponectin)受體(ti) ，AdipoR1和AdipoR2，進行了結構解析，發現脂聯素受體(ti) 具有與(yu) G蛋白偶聯受體(ti) 不同的七次跨膜螺旋，對於(yu) 靶向脂聯素受體(ti) 的肥胖及其相關(guan) 代謝疾病治療方法開發具有重要意義(yi) 。

　　在該項研究中，研究人員對人類AdipoR1和AdipoR2的晶體(ti) 結構進行了解析，分辨率分別達到2.9 ?和2.4 ?，他們(men) 通過解析發現脂聯素受體(ti) 是具有不同結構的一類新受體(ti) 。脂聯素受體(ti) 的這種七次跨膜螺旋在構象上與(yu) G蛋白偶聯受體(ti) 的七次跨膜螺旋不同，在這種新的 七次跨膜螺旋中，由三個(ge) 保守組氨酸殘基協同一個(ge) 鋅離子形成了一個(ge) 大的腔體(ti) 。這種鋅結合結構可能在adiponectin刺激的AMPK磷酸化和UCP2表達上調方麵具有一定作用。(Nature, 16 April 2015, doi:10.1038/nature14301 )

　　9. Molecular Cell：中國科學家揭示A型流感病毒RNA聚合酶複合體(ti) 的三維冷凍電鏡結構

　　2015年1月22日，中科院生物物理所劉迎芳研究組與(yu) 清華大學王宏偉(wei) 研究組在期刊Molecular Cell雜誌在線發表了題目為(wei) “Cryo-EM Structure of Influenza Virus RNA Polymerase Complex at 4.3 ? Resolution”的論文，揭示了流感病毒RNA聚合酶複合體(ti) 的結構和功能。

　　生物物理所劉迎芳和清華大學王宏偉(wei) 課題組等中外多方參與(yu) 的實驗室通過使用的高分辨率單顆粒冷凍電鏡三維重構技術，解析了含有A型流感病毒RNA聚合酶大部分成分的4.3埃分辨率的四聚體(ti) 電鏡結構。該複合體(ti) 涵蓋了流感病毒聚合酶催化活性的核心區域。從(cong) 三維重構密度圖中可以清晰識別出該空腔內(nei) PB1上的催化結構域以及結合的RNA複製起始鏈，據此，研究人員推測這是進行RNA合成反應的區域。這一活性中心結構與(yu) 正鏈RNA聚合酶具有相似性，研究人員也因此提出了流感病毒合成新生RNA鏈的機製。(Molecular Cell, 5 March 2015, doi:10.1016/j.molcel.2014.12.031)

　　10. Cell：科學家獲得*中介體(ti) 複合物結構圖

　　中介體(ti) 複合物(Mediator Complex)是細胞中zui大也zui為(wei) 複雜的分子機器之一。現在，來自斯克利普斯研究所(TSRI)的科學家們(men) 在《細胞》雜誌上報告稱，他們(men) 利用用電鏡獲得了*中介體(ti) 複合物(Mediator)的結構圖。

　　Mediator是所有動植物細胞中的關(guan) 鍵分子機器，對於(yu) 絕大多數基因的轉錄有著至關(guan) 重要的調控作用。Mediator擁有二十多個(ge) 蛋白亞(ya) 基，解析它的結構是基礎細胞生物學的一大進步。這一成果能夠為(wei) 許多疾病提供寶貴的線索(從(cong) 癌症到遺傳(chuan) 性的發育疾病)。論文資深作者，TSRI副教授Francisco Asturias表示："明確這些大分子機器的結構和作用機製，可以幫助我們(men) 理解許多關(guan) 鍵的細胞過程。"

　　在這項新研究中，研究人員獲得了高純度的酵母Mediator，並通過電鏡成像得到了迄今為(wei) 止zui為(wei) 清晰的Mediator3D模型，分辨率達到約18埃。隨後他們(men) 又進行了多種生化分析，例如在逐個(ge) 去除蛋白亞(ya) 基的同時觀察電鏡圖像發生的改變。他們(men) 由此確定了酵母Mediator25個(ge) 蛋白亞(ya) 基的定位。

　　項新研究獲得的結構圖譜，全麵修正了之前的Mediator'粗略模型。論文*作者Kuang-LeiTsai表示："定位了所有的蛋白亞(ya) 基之後，我們(men) 發現頭部模塊應該位於(yu) Mediator的頂部而不是底部。"此外，研究人員還對人類Mediator進行了深入研究。Tsai說："大體(ti) 上看，人類和酵母的Mediator總體(ti) 結構頗為(wei) 類似。"zui後研究人員在結構數據的基礎上，為(wei) 人們(men) 展示了Mediator調控轉錄時的構象變化。